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2005年底江蘇某豬場飼養的商品肉豬群中部分豬只陸續發生高熱、皮膚發紺、呼吸困難等癥狀，病程一般持續5～7天，發病豬一般以死亡為轉歸，發病豬在瀕死前發生全身抽搐等神經癥狀。不同年齡段的豬群中均有不同程度的發生，臨床表現基本相似。通過臨床病理剖檢和實驗室診斷相結合的方法，診斷為豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征，豬圓環病毒2型混合感染。?
1 材料與方法 ?
1.1 細菌培養基 巧克力培養基、綿羊血平板均按常規方法制備。?
1.2 熒光抗體 FITC標記的豬瘟熒光抗體購自中國獸醫藥品監察所。?
1.3 PCR引物 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）特異的PCR引物參照Gilbert等的方法合成，引物序列為：PRRSV??F?：5′?CCTCCTGTA?TGAACTTGA?3′；PRRSV??F?：5′?AGGTCCTCG?AACTTGAGCTG?3′。豬圓環病
毒2型（Porcing circovirus type 2，PCV?2）特異的PCR引物參照Larochelle等的方法合成，引物序列為：PRRSV??F?：5′?TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT?3′；PRRSV??F?：5′?CCGCACCTTCGGATATACTG?3′。〖KG-?6〗所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。?
1.4 分子生物學試劑 M?MLV反轉錄酶購自Promega 公司；dNTP、RNAsin、Taq DNA聚合酶、等購自大連TaKaRa公司；Trizol購自上海生工生物工程有限公司；100bp DNA 梯度Marker購自MBI公司。?
1.5 病料采集 對部分發病比較嚴重的或剛剛死亡的豬進行仔細剖檢，分別采集鼻腔分泌物、心包液、心血、心、肝、脾、肺、腎等病料，供實驗室檢測用。?
1.6 細菌學檢驗 將采集的鼻腔分泌物、心血、心包積液分別涂片，革蘭氏染色后進行顯微鏡檢查。同時將心血和心包積液接種綿羊血平板和巧克力瓊脂，37℃培養48 h觀察結果。
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1.7 豬瘟抗原檢測 采用間接免疫熒光試驗法，取病、死豬的扁桃體、淋巴結、脾進行組織觸片，自然干燥后用冷丙酮-20℃固定20 min，再用PBS（pH7.2）洗滌3次，每次5 min，滴加豬瘟熒光抗體，37℃濕盒作用30 min，用PBS洗滌3次，每次5 min，干后滴加甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡檢查。?
1.8 PRRSV和PCV?2的PCR檢測??
1.8.1 核酸提取 病料RNA和DNA用Trizol試劑提取，按照說明書提供的方法進行。首先將病料剪碎，用研磨器勻漿后制成1∶10懸液，取100 μl樣品加入1 ml Trizol試劑，混勻后室溫作用5 min，加入200 μl氯仿，振蕩混勻后室溫作用5 min，12 000 r/min離心5 min，將上清移入新的滅菌指形管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置5 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀兩次，室溫吹干，用30 μl DEPC處理的滅菌超純水溶解沉淀。一半用PRRSV?R引物進行反轉錄，另一半直接用作PCV?2的PCR檢測。?
1.8.2 反轉錄 反轉錄體系為25 μl，其中含?5×M??MLV緩沖液5 μl，RNA 12.5 μl，2.5 mmol dNTP ?5 μl?，PRRSV?R引物1 μl，RNAsin 0.5 μl，M?MLV反轉錄酶1 μl。混勻后，37℃作用1 h，95℃作用5 min滅活M?MLV反轉錄酶。?
1.8.3 PCR試驗 PCR反應體系為25 μl，其中含?10×?Taq DNA聚合酶緩沖液2.5μl，2.5 mmol dNTP 2 μl，上、下游引物各0.5 μl，模板2 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，滅菌超純水18 μl。PRRSV檢測PCR反應條件為：94℃預變性?3 min?后，94℃ 20 s、42℃ 1 min、72℃ 1
min進行1個循環，然后94℃ ?20 s?、47℃ 1 min、72℃ 1 min進行40個循環，最后72℃ 15 min。PCV?2檢測PCR反應條件為：?95℃? ?1 min?、65℃ 1 min、72℃ 1 min進行35個循環，最后72℃ 10 min。〖JP〗?
1.8.4 電泳 PCR反應結束后，取10 μl PCR產物加入2 μl 6×上樣緩沖液用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，用100 bp DNA梯度Marker作為參照。PRRSV和PCV?2的預期PCR產物大小分別為255 bp和?263 bp?。
2 結果 ?
2.1 剖檢表現 所有豬均表現為肺充血、出血和間質性肺炎，脾臟腫大，腎臟色淡，少數
豬有心包積液和鼻腔黏液。?
2.2 細菌學檢查結果 心血和心包液染色鏡檢后未見有細菌，鼻腔分泌物中也未見可疑細菌，心血和心包液接種綿羊血平板和巧克力瓊脂也未見有細菌生長。?
2.3 豬瘟抗原檢測結果 將病料組織觸片后通過熒光抗體染色后，在熒光顯微鏡下可見完整細胞胞漿內有大量黃綠色熒光，結果見圖1。?
2.4 PCR檢測結果 PCR產物電泳檢測結果表明，PRRSV和PCV?2 PCR檢測產物大小分別255 bp和263 bp，與預期大小相符，結果見圖2。
3 討論與分析 ?
3.1 隨著我國養豬業集約化程度的提高，種豬和生豬跨地域運輸越來越頻繁，使得豬群傳染病的發生越來越復雜。在很多豬場，都同時存在多種病原的混合感染。本文所報道的豬場經過診斷，同樣也是被確診為豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2型3種病毒的混合感染。?
3.2 該場引進每一批豬后，均及時用5倍劑量的豬瘟兔化弱毒疫苗進行免疫，但是仍然發生了豬瘟疫情，原因可能有：
(1)由于免疫豬的免疫狀況背景不清楚，可能在引進前抗體水平較低，甚至已經發生了豬瘟病毒的感染。
(2)根據現階段的豬瘟流行的嚴重程度，很多豬場所采取的免疫程序中，均安排了多次豬瘟疫苗的免疫接種，而該場僅在引進后進行了一次免疫接種，因而可能不能產生堅強的免疫力。
(3)該場還同時存在豬繁殖與呼吸綜合征和圓環病毒2型的混合感染，而這兩種病毒根據現有的研究結果表明，感染后均能夠造成宿主的的免疫抑制，因此可能會感染豬瘟疫苗免疫效力的發揮，而且該場并未接種除豬瘟疫苗以外的其他疫苗，因而對豬繁殖與呼吸綜合征等疾病高度易感。?
3.3 針對該場的現狀，筆者建議：
(1)暫停從引進外來豬只，對已經發病的豬只進行撲殺和嚴格的無害化處理，對同群豬用豬瘟兔化弱毒苗和豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗進行緊急接種，加強環境衛生和定期消毒。
(2)在所有豬只都出欄后，全場徹底消毒，并空場2～3個月以上。
(3)逐步建立自繁自養制度。
(4)不同年齡的豬分群飼養并固定專人管理。
(5)制定合理的免疫程序。該場在采納了上述的建議后，豬場發病率逐漸下降。?
