對免疫接種的II組和III組共12頭野豬進行檢測，在它們和攻毒后攜帶ASFv的野豬直接接觸的24天后，其中有11頭野豬對ASFv表現(xiàn)出良好的免疫效果，沒有發(fā)病反應(yīng)，經(jīng)過免疫接種的II組和III組的12頭野豬的存活率為92%。

西班牙國家暨世界動物衛(wèi)生組織(OIE)非洲豬瘟病毒研究實驗室主任、西班牙馬德里康普頓斯大學獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)測中心教授

自上世紀60年代算起，針對非洲豬瘟病毒(ASFv)疫苗研發(fā)已接近60年，但由于對ASFv感染保護性免疫諸多方面的研究和認知尚不夠清楚，針對傳統(tǒng)滅活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、病毒活載體疫苗、減毒活疫苗、基因突變疫苗(包括基因缺失疫苗)的研發(fā)方面亦未取得比較大的進展。

目前，全球至少8個國家15個研究機構(gòu)正致力于ASFV疫苗研發(fā)。2019年1月，中國啟動非洲豬瘟病毒基因缺失活疫苗研發(fā)項目。2018年10月，碩騰公司(Zoetis)被授予獨家使用由美國康涅狄格大學研究發(fā)布的“基于MGF基因缺失的減毒非洲豬瘟疫苗”的專利。2018年3月，西班牙的科學家發(fā)表防控ASFv感染的缺失某些特定基因的弱毒活疫苗的研究成果。2017年底，歐盟發(fā)起了針對ASFv疫苗的創(chuàng)新行動。

由于ASFv基因突變疫苗(包括基因缺失疫苗)可以提供完全保護作用，是目前最具開發(fā)潛力的疫苗。雖然非洲豬瘟病毒對家豬造成的威脅更嚴重，但野豬ASFv疫苗的開發(fā)對全球ASF控制與根除有著重要意義，特別是非洲地區(qū)和歐盟地區(qū)，其次是中國，因為中國不少地區(qū)野豬分布比較密集，且將來野豬感染ASFv的情況在中國會更加嚴重，而森林ASFv傳播管理也不可忽視。在今年3月于北京舉行的2019年國際豬業(yè)科學論壇上，世界知名非洲豬瘟專家、對非洲豬瘟有著40年研究經(jīng)驗的西班牙國家暨世界動物衛(wèi)生組織(OIE)非洲豬瘟病毒研究實驗室主任、西班牙馬德里康普頓斯大學獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)測中心教授何塞·馬紐埃爾比·桑切斯·斯凱諾(José Manuel Sanchez-Vizcaino)在《首個針對ASF病毒基因Ⅱ型毒株的野豬口服疫苗的研發(fā)與試驗情況》主題報告表示，目前經(jīng)過免疫攻毒試驗表明，這種ASFv基因突變疫苗對野豬具有較好的免疫效果，且具有較好的安全性，下一步將進行野豬實際免疫接種研究以及家豬免疫接種實驗研究。

“非洲豬瘟病毒既有森林的傳播，也有家畜之間的傳播。我們要研究為什么非洲軟蜱、非洲野豬/非洲疣豬ASFv耐受，雖然它們長期攜帶ASFv，但它們不發(fā)病。我們希望能有疫苗對這些ASFv宿主和傳播ASFv的動物進行免疫接種，從而根除ASF病毒。”桑切斯·斯凱諾說，“我在研究非洲豬瘟第一年的時候，就考慮過如何開發(fā)此類疫苗的問題。當時，我們實驗室開發(fā)了一種ASFv疫苗，但給一些野豬接種這種疫苗后，發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)野豬反而因此致死。鑒于此，我們這40多年來投入大量時間和精力進一步開發(fā)ASFv疫苗。幸運的是，我們在ASFv疫苗方面的研發(fā)目前已取得初步成效。”

“很多時候，ASFv滅活疫苗的保護作用非常不明顯，實際效果也很有限。”桑切斯·斯凱諾分析說，對于所有的ASFv基因型來說，雖然ASFv減毒活疫苗往往會帶來更多的保護，但由于它存在殘余毒力、病毒血癥、亞臨床癥狀等安全性問題，具有致病風險，安全性不高。因此，“我們轉(zhuǎn)向ASFv基因突變疫苗的研發(fā)。通過多年研究開發(fā)，現(xiàn)已獲得突破性進展，感覺像得到一份圣誕節(jié)大禮物一樣。”

“2017年，拉脫維亞發(fā)生非洲豬瘟疫情，這次疫情感染率非常高，主要是感染ASFv基因II型毒株。當時，我們在拉脫維亞發(fā)現(xiàn)了一頭感染ASFv基因II型毒株的野豬，經(jīng)取樣后，在我們實驗室進行檢測、研究。”桑切斯·斯凱諾說，“我們對此發(fā)病野豬樣品中的ASFv基因進行排序之后，發(fā)現(xiàn)其中有基因發(fā)生突變，我們對它的突變基因進行研究后，開發(fā)了世界首個ASF病毒基因II型毒株野豬口服疫苗(Lv17/WB/RIE1，通過對拉脫維亞2017年感染ASFv的發(fā)病野豬的突變基因研究而開發(fā)的疫苗)。在此，向大家介紹針對此疫苗的兩個實驗：一個是這種ASFv基因II型口服疫苗的野豬免疫接種及免疫強毒攻毒實驗;另外一個是針對這種ASFv基因II型毒株口服疫苗免疫野豬進行的強毒攻毒交叉感染及其保護效果的實驗;這兩個實驗中，攻毒均采用ASF病毒Armenia 07基因II型強毒株(亞美尼亞2007年發(fā)生非洲豬瘟疫情，主要為ASFv基因II型，感染率也非常高)。”

他還介紹說，這兩個實驗持續(xù)了近兩個月的時間，采用了TCID50 測定(組織半數(shù)感染量，即指能在培養(yǎng)板孔或試管內(nèi)引起半數(shù)細胞病變或死亡所需的病毒量)、 紅細胞吸附試驗(HAD)、實時熒光PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))、免疫過氧物酶試驗(IPT)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)等方法，每周對實驗組和對照組野豬的全血、血清、唾液、排泄物、直腸溫度檢測兩次，結(jié)合病毒血癥、抗原、臨床癥狀、剖檢結(jié)果做了綜合分析和研究。

“在這兩個實驗中，我們一共選了18頭月齡為3～4個月的小野豬。實驗前，它們單個體重為10～15千克;實驗結(jié)束后，它們單個體重增加到20～25千克。”桑切斯·斯凱諾說，“在西班牙，人們會獵撲一些野豬進行養(yǎng)殖。我們購買的這些進行實驗的小野豬，均來自于當?shù)氐囊患茵B(yǎng)豬場。”

“第一個實驗主要是檢驗實驗組(接種這種ASFv基因II型毒株口服疫苗后的野豬)的免疫應(yīng)答、臨床癥狀、攻毒感染及死亡情況。”桑切斯·斯凱諾說，第一個實驗中，對照組共有6頭野豬，實驗組共有12頭野豬：

√I組(BOX1)：對照組,有6頭未感染ASFv的野豬;

√II組(BOX2)：實驗組，有5頭野豬，其中4頭通過口服免疫接種，1頭通過接觸進入體內(nèi)的方式免疫接種;

√III組(BOX3)：實驗組，有7頭野豬，其中5頭通過口服免疫接種，2頭通過接觸進入體內(nèi)的方式免疫接種。

√與對照組比較，唯一有區(qū)別的臨床癥狀是體溫變化——實驗組中的12頭野豬中，有8頭野豬平均體溫為40.1～40.8 °C，有輕微的升高;

√經(jīng)實時熒光PCR檢測結(jié)果顯示，病毒血癥方面，偶發(fā)(零星出現(xiàn))弱陽性表達——12頭野豬中，有8頭Ct值等于33.02±4.07(Ct values，Cycle threshold values，即循環(huán)閾值，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。

通過ELISA抗體(AB)檢測的數(shù)據(jù)顯示：

√在免疫接種后的第1周(第1天到第7天)，抗體檢測沒有明顯變化;

√在免疫接種一周后(第7天到第30天)，抗體檢測呈現(xiàn)陽性的野豬數(shù)量開始增加，抗體陽性率開始上升;

√到免疫接種第30天(攻毒前一天)，實驗組12頭野豬中，抗體檢測呈現(xiàn)陽性的野豬數(shù)量達到8頭：9頭口服免疫接種的野豬中，有6頭抗體檢測呈現(xiàn)陽性;3頭采用接觸進入體內(nèi)的方式免疫接種的野豬中，有2頭抗體檢測呈現(xiàn)陽性;實驗組抗體陽性率達到66.6%;

√在免疫接種后的第31天，用ASF病毒Armenia 07基因II型強毒株對實驗組的野豬進行攻毒，在攻毒后的前5天(免疫接種后的第31天到第35天)，實驗組的野豬抗體陽性率較攻毒前一天開始升高，雖然升高幅度較小，但已超過70%這一臨界值;在攻毒后的第6天到第10天(免疫接種后的第35天到第41天)實驗組的野豬抗體陽性率明顯升高，在攻毒后的第8天升高幅度出現(xiàn)略微減小趨勢;在攻毒后的第9天(免疫接種后的第40天)，實驗組的野豬抗體陽性率達到90%左右。

“從以上抗體檢測結(jié)果來看，實驗組免疫接種及免疫攻毒的整體抗體陽性率均保持較高水平，這說明我們開發(fā)的這種ASFv基因II型毒株口服疫苗對野豬具有較好的免疫效果(ELISA檢測的抗體陽性率越高，說明豬群對ASFv免疫效果/攻毒保護效果越好)。” 桑切斯·斯凱諾如此分析說。

桑切斯·斯凱諾介紹說，第二個實驗中，對未感染ASF病毒的6頭野豬中的4頭野豬，進行ASF病毒 Armenia 07基因II型強毒株攻毒，2頭作為攻毒試驗對照的野豬，然后將它們分成2組，分別與免疫接種這種ASFv基因II型毒株口服疫苗30天的II組、III組的野豬混養(yǎng)(見上圖)。然后，通過取樣檢測，來監(jiān)測攻毒后已感染ASFv的野豬會否將它們攜帶的ASFv傳染給同組混養(yǎng)的其他野豬，并監(jiān)測同組野豬之間會否發(fā)生ASFv交叉?zhèn)魅镜那闆r。

√I組(BOX1)：6頭未感染ASFv的野豬被分成2批：第1批3頭野豬，作為攻毒試驗對照(未感染ASFv)的野豬1頭，通過肌肉注射(IM)方式進行攻毒(通過肌肉注射方式，感染ASF病毒Armenia 07基因II型強毒株，下同)的野豬2頭，然后與II組的野豬混養(yǎng)在一起;第2批3頭野豬：作為攻毒試驗對照(未感染ASFv)的野豬1頭，通過肌肉注射方式進行攻毒的野豬2頭，然后與III組的野豬混養(yǎng)在一起;

√II組(BOX2)：在免疫接種的第1天到第30天，有5頭野豬，其中4頭通過口服免疫接種，1頭通過接觸進入體內(nèi)的方式免疫接種;自攻毒第1天(免疫接種第31天)起，II組混養(yǎng)有8頭野豬。

√III組(BOX3)：在免疫接種第1天到第30天，有7頭野豬，其中5頭通過口服已經(jīng)免疫接種，2頭通過接觸進入體內(nèi)的方式已經(jīng)免疫接種;在這2頭采用接觸進入體內(nèi)的方式已經(jīng)免疫接種的野豬中，對其中1頭采用肌肉注射方式進行攻毒;自攻毒第1天(免疫接種第31天)起，III組混養(yǎng)有10頭野豬。

桑切斯·斯凱諾分析稱，通過54天的免疫接種與24天的免疫攻毒混養(yǎng)監(jiān)測結(jié)果顯示：

√對免疫接種的II組和III組的12頭野豬(包括1頭采用肌肉注射方式攻毒的已免疫接種的野豬)進行檢測，采用口服免疫接種的1頭野豬在和攻毒后攜帶ASFv的野豬直接接觸后的第5天，因感染ASFv而死亡，II組和III組12頭野豬的死亡率為8%;

√對免疫接種的II組和III組共12頭野豬進行檢測，在它們和攻毒后攜帶ASFv的野豬直接接觸的24天后，其中有11頭野豬對ASFv表現(xiàn)出良好的免疫效果，沒有發(fā)病反應(yīng)，II組和III組的12頭野豬的存活率為92%。

“通過以上兩個實驗研究分析，我們找到了3個問題的答案。”桑切斯·斯凱諾總結(jié)說：

√第一，疫苗的免疫效果和安全性問題。我們開發(fā)的這種ASFv基因II型毒株口服疫苗對野豬能夠產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，沒有造成野豬不良反應(yīng)，也沒有出現(xiàn)野豬死亡的現(xiàn)象，說明這種ASFv疫苗對野豬的免疫效果和安全性均較高。

第二，免疫接種后，會否通過直接接觸的方式感染ASFv?感染率高還是低?這個答案是肯定的，但感染率較低(8%)。因為監(jiān)測顯示，免疫接種后的12頭野豬與感染ASFv的野豬混養(yǎng)在一起進行直接接觸后，經(jīng)過3～4天的時間，免疫接種的野豬中就會發(fā)生感染ASFv的現(xiàn)象，但僅有1頭口服免疫接種的野豬被感染，然后在混養(yǎng)直接接觸后的第5天因此致死。

第三，這種ASFv疫苗能不能對交叉感染起到良好的保護作用?通過監(jiān)測來看，我們開發(fā)的這種ASFv疫苗對ASF病毒Armenia 07基因II型強毒株的交叉感染具有良好的保護效果，經(jīng)過免疫接種的II組和III組的12頭野豬當中，經(jīng)檢測有11頭沒有發(fā)病發(fā)應(yīng)，存活率為92%。

“針對我們實驗室開發(fā)的這種野豬ASF病毒基因II型毒株口服疫苗，我們對接種這種免疫疫苗后的未發(fā)病野豬和攻毒感染ASF病毒Armenia 07基因II型強毒株(Armenia/07)后的發(fā)病野豬進行了剖檢，并對它們各自的臟器組織和淋巴器官進行病理比較研究發(fā)現(xiàn)，前者和后者的多個臟器組織及多處淋巴器官有著明顯差異(見上圖)。”桑切斯·斯凱諾如此分析說。

“我們研究分析了18組臟器組織和淋巴器官等部位的變化情況，包括脾臟、腎臟、肝臟、肺臟、心臟、腦部、骨髓、膀胱、腸道、扁桃體以及下頜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、咽后淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、胃部與肝臟之間的淋巴結(jié)、肩胛骨前的淋巴結(jié)、腎部淋巴結(jié)、縱隔淋巴結(jié)。” 桑切斯·斯凱諾表示，與免疫接種后的未發(fā)病野豬比較，感染ASFv后的發(fā)病野豬的脾臟發(fā)生腫大的癥狀尤為明顯，還有林巴系統(tǒng)病變、肺部感染發(fā)炎、腸道系統(tǒng)病變也比較明顯。

“為了進一步檢驗這種ASF病毒基因II型毒株口服疫苗的免疫效果，我們還通過實時熒光PCR對對照組和實驗組的共18頭野豬的16個組織進行剖檢，如圖從左到右依次排列為4組，每組4個組織，包括：骨髓、腦部、胃部與肝臟之間的淋巴結(jié)、心臟;腹股溝淋巴結(jié)、腎臟、肝臟、肺臟;縱隔淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、肩胛骨前的淋巴結(jié)、腎部淋巴結(jié);咽后淋巴結(jié)、脾臟、下頜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、咽后淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、胃部與肝臟之間的淋巴結(jié)、肩胛骨前的淋巴結(jié)、腎部淋巴結(jié)、膀胱系統(tǒng);并將檢測所得Ct值(Ct values，Cycle threshold values，即循環(huán)閾值，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))與剖檢最后一次檢測到病毒血癥的天數(shù)進行比較，以此來確定ASFv的水平。” 桑切斯·斯凱諾說，“圖中的藍色表示已免疫接種，灰色表示已免疫接種但沒有保護作用，黃色表示后期有接觸，紅色表示進行采用肌肉注射方式進行攻毒。從這16個組織各自的Ct值來看，目前的免疫效果良好，且我們開發(fā)的這種野豬口服疫苗免疫接種所用的劑量不是特別高，實驗結(jié)果比較滿意。”

“目前，這種ASFv疫苗對野豬進行免疫接種的效果比較穩(wěn)定，我們對這種疫苗的研發(fā)還在持續(xù)進行中，我們將通過研究比較每頭野豬服用更多劑量與服用更少劑量有什么區(qū)別，是不是前者的免疫效果比后者更好、保護性更安全。”桑切斯·斯凱諾說，“下一步，我們希望針對這種疫苗能夠進行體內(nèi)和體外的免疫接種研究，并確定針對野豬群中的每頭野豬在實際使用過程中免疫接種的最佳劑量，以及進行免疫接種的最佳時間和最佳間隔周期。”

“截至目前，我們對這種ASF病毒基因II型毒株野豬口服疫苗免疫接種和免疫攻毒的實驗研究進行了50天，我們認為這一時間還不夠長。”桑切斯·斯凱諾表示，“未來，我們將投入更長時間對這種疫苗進行野豬免疫接種的實驗研究和野豬群免疫接種的實際應(yīng)用研究，分析實驗室和實際應(yīng)用中的免疫效果分別能夠持續(xù)多長時間;同時，我們還希望對家豬做進一步的免疫接種和免疫攻毒實驗，以此研究家豬對這種疫苗的免疫反應(yīng)、免疫效果，以及這種疫苗在家豬免疫接種過程中的安全性和保護性。”

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