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1.口蹄疫血清學(xué)效力檢測(cè)替代方法
通過(guò)檢測(cè)疫苗免疫后的抗體滴度水平來(lái)評(píng)價(jià)疫苗免疫效力，檢測(cè)方法主要包括病毒中和試驗(yàn)和各種ELISA試驗(yàn)。1968年，Stellman等¨馴提出了用中和抗體滴度分析疫苗效力的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法;到1976年，Pay等¨引根據(jù)中和抗體滴度和疫苗效力的關(guān)系建立了疫苗的抗原劑量、中和抗體滴度和保護(hù)率的相關(guān)公式。世界各國(guó)的研究工作者都嘗試用血清學(xué)方法評(píng)價(jià)疫苗的效力，以替代本動(dòng)物的效力檢驗(yàn)方法，取得了一定的進(jìn)展。上世紀(jì)80年代，Black等Ⅲ1提出抗體平均值預(yù)測(cè)方法，試驗(yàn)建議用平均中和抗體滴度1.7410910作為疫苗合格的判斷標(biāo)準(zhǔn)。2003年，Bar-nett等舊川采用bootstrap的方法進(jìn)行疫苗效力測(cè)定，試驗(yàn)首先通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析獲得回歸方程，將免疫21d測(cè)定的中和抗體結(jié)果代入公式預(yù)算某個(gè)稀釋度的疫苗保護(hù)率。2007年，Coils等怕1采用回歸方程結(jié)合ROC(Receive Operating Characteristic)曲線確定了抗體滴度最佳臨界點(diǎn)和可疑值范圍，用最佳臨界點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)某個(gè)動(dòng)物是否保護(hù)，然后再計(jì)算PD卯。血清學(xué)試驗(yàn)不需要在動(dòng)物舍內(nèi)進(jìn)行有毒性的操作，減少了病毒向外界散播的危險(xiǎn);不需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行攻毒，消除了攻毒試驗(yàn)給動(dòng)物帶來(lái)的損害；還省去了攻毒后的觀察期，縮短了試驗(yàn)周期。抗體滴度測(cè)定使試驗(yàn)從定性(死亡或出現(xiàn)臨床癥狀)走向了定量，排除了人為判定誤差或試驗(yàn)動(dòng)物健康狀況影響試驗(yàn)結(jié)果;與攻毒程序相比，血清學(xué)試驗(yàn)可以對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行保存，當(dāng)產(chǎn)品上市出現(xiàn)問(wèn)題或管理機(jī)構(gòu)要對(duì)疫苗進(jìn)行復(fù)檢時(shí)可應(yīng)用保存的樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。有的動(dòng)物有很高的抗體梯度，但攻毒后仍然發(fā)病;有的動(dòng)物幾乎檢測(cè)不到抗體，但卻受到了保護(hù)，這些現(xiàn)象表明僅靠抗體水平衡量動(dòng)物是否被保護(hù)是欠妥的。由于不同試驗(yàn)室所用的檢測(cè)方法、試劑以及判斷標(biāo)準(zhǔn)等方面難以統(tǒng)一，以至這類研究結(jié)果應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中存在困難。另外，檢測(cè)免疫血清抗體效價(jià)須用非口蹄疫疫苗免疫動(dòng)物，無(wú)法從根本上取代本動(dòng)物的使用，動(dòng)物的選擇仍存在困難。
2.疫苗抗原定量方法
FMDV在蔗糖密度梯度離心時(shí)根據(jù)沉降系數(shù)不同可以分為幾種病毒粒子，分別是完整病毒(146S)、空衣殼(75S)、病毒感染相關(guān)成分(45S)和12S蛋白亞單位(12S)。146S抗原顆粒是口蹄疫疫苗中使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的主要免疫原成分，因此146S抗原顆粒的含量被視為與口蹄疫疫苗的效力具有平行關(guān)系。上世紀(jì)70年代，各種146S抗原顆粒定量的方法相繼報(bào)道，如免疫擴(kuò)散法，蔗糖密度梯度離心法，ELISA抗原定量法等，其中較常用的方法是蔗糖密度梯度離心法。1971年，F(xiàn)ayet等舊1首次建立了用紫外光定量蔗糖梯度中口蹄疫病毒粒子146S抗原顆粒的方法；1974年，Barreling等舊。在此基礎(chǔ)上做了改進(jìn)，使此方法更加精確敏感。DoelⅢo進(jìn)一步發(fā)展和標(biāo)準(zhǔn)化了這個(gè)方法，并于1982年向OIE正式推薦了這個(gè)方法。1990年，Junsuke等哺。用蔗糖密度梯度離心法對(duì)口蹄疫滅活疫苗中的146S抗原顆粒純化后，用軟件CDS系統(tǒng)對(duì)146S抗原顆粒實(shí)現(xiàn)了電腦自動(dòng)化定量。有研究者還開(kāi)展了146S抗原顆粒含量與疫苗的本動(dòng)物效力(PD∞)相關(guān)性的研究。試驗(yàn)證明，在一定的范圍內(nèi)，146S抗原顆粒的含量與疫苗效力有相關(guān)性。Rweyemamuml分析了口蹄疫滅活疫苗中抗原含量與免疫動(dòng)物抗體水平的關(guān)系，確定了牛的抗體水平與疫苗146S抗原顆粒含量呈0.16log。
目前，豬場(chǎng)動(dòng)力網(wǎng)感謝您的訪問(wèn)。體外抗原定量試驗(yàn)替代滅活疫苗的效力試驗(yàn)存在一些障礙：其一，大量的疫苗產(chǎn)品中含有佐劑等成分，抗原在進(jìn)行測(cè)定之前必須與疫苗中的其他成分分開(kāi)，并且要保證抗原的完整性;其二，免疫試劑對(duì)146S抗原顆粒定量測(cè)定存在一些干擾，比如用ELISA方法測(cè)定抗原含量時(shí)，ELISA中的單克隆抗體不能完全辨別抗原的所有功能區(qū)域，從而使抗原的量化不能完全反映抗原的免疫原性和本動(dòng)物接種疫苗后一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng)。
3.總結(jié)和展望
口蹄疫滅活疫苗本動(dòng)物效力檢驗(yàn)替代方法的探索是國(guó)內(nèi)現(xiàn)面臨和亟待解決的一個(gè)問(wèn)題，有效的替代方法應(yīng)該具有很好的特異性、敏感性和重復(fù)性，而且要易于標(biāo)準(zhǔn)化。體外替代方法如血清學(xué)試驗(yàn)和抗原定量試驗(yàn)在生物安全、動(dòng)物福利、效率和試驗(yàn)監(jiān)測(cè)等方面具有優(yōu)點(diǎn)。但這兩種方法是對(duì)保護(hù)性的間接測(cè)定，僅能反映部分免疫反應(yīng)的過(guò)程。如果抗體滴度或抗原含量與保護(hù)性不存在線性或其他曲線關(guān)系，或者保護(hù)性受細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)影響，血清學(xué)試驗(yàn)、抗原含量測(cè)定與保護(hù)性反應(yīng)就不存在相關(guān)性，這樣的體外替代方法很難完全替代本動(dòng)物的效力檢驗(yàn)。替代試驗(yàn)動(dòng)物易于規(guī)�；�飼養(yǎng)，均一性易控制。應(yīng)用成本較低的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)可通過(guò)增加試驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量而獲得更加精確的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。替代試驗(yàn)動(dòng)物可以模擬疫苗免疫接種后抗原在體內(nèi)通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)呈遞的過(guò)程、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、疫苗佐劑產(chǎn)生的效應(yīng)和靶組織的特異性等體外試驗(yàn)無(wú)法測(cè)定的過(guò)程。但替代試驗(yàn)動(dòng)物模型只可能在某些方面與本動(dòng)物的免疫反應(yīng)和發(fā)病機(jī)理具有相似性，不可能完全復(fù)制本動(dòng)物的真實(shí)情況。替代試驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況、免疫劑量、攻毒方法等也會(huì)對(duì)試驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。伴隨全世界減少或取消動(dòng)物試驗(yàn)的需求，攻毒試驗(yàn)給發(fā)病動(dòng)物帶來(lái)的痛苦也違反了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則，就在科學(xué)研究中的應(yīng)用。結(jié)合現(xiàn)階段口蹄疫滅活疫苗效力檢驗(yàn)替代方法的研究狀況，我們認(rèn)為在疫苗質(zhì)量控制中，可以在生產(chǎn)階段用抗原含量測(cè)定的方法保證疫苗中有效抗原的含量；而在成品疫苗的效力檢驗(yàn)時(shí)嘗試將體外檢測(cè)方法與動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)方法相結(jié)合進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，大批量的終產(chǎn)品檢驗(yàn)可以通過(guò)體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)，從而減少試驗(yàn)的數(shù)量；在終產(chǎn)品的組分發(fā)生改變時(shí)用動(dòng)物進(jìn)行效力檢驗(yàn)，以探索一種有較好重復(fù)性、可靠性和易于標(biāo)準(zhǔn)化的替代方法。
